引物设计教程:如何设计引物?

1、开始要拿到本人要安排引物的手段基因。这边我运用一段GFP基因给大师解说。将手段基因生存在txt文书档案内里,大概径直复制下来后在DNAMAN内里兴建文书档案复制进去。底下是咱们要安排引物的GFP基因序列。

引物设计教程:如何设计引物?  第1张

2、翻开DNAMAN,采用菜单内里的Primer-->Load Primer-->From Input。将上一步中的手段基因序列从发端发端的20个安排的碱基复制粘贴进去(引物长度要在15—30bp之间,常用的是18-27bp),比方咱们先试试前20个碱基能否符合,将ATTGATGTGATATCTCCACT这20个碱基复制粘贴进去,点击OK。

引物设计教程:如何设计引物?  第2张

3、再次点击Primer,采用Melting Temperature,翻开对话框。这内里不妨看到你的碱基序列,个数以及Thermo,也即Tm值,是融化温度。Tm值普遍在55℃到70℃之间比拟好,PCR仪的退火温度普遍设定比primer的Tm低5℃(然而普遍情景咱们都设定于55℃,所以Tm值在60安排比拟好)。

引物设计教程:如何设计引物?  第3张

4、从上海图书馆不妨看到咱们这20个碱基的Tm值惟有49度,明显太低,须要减少碱基数目。咱们取前24个碱基粘贴进去,点击下方Show Tm便不妨看到这个引物的Tm值,创造是60.3度,很符合,就用这个了。如许正向引物就安排结束,把这24个碱基序列生存下来。

引物设计教程:如何设计引物?  第4张

5、安排反向引物须要将手段基因序列举行反向互补,而后依照正向引物一律的本领安排便可。反向互补操纵不妨在DNAMAN内里赶快简单举行。翻开DNAMAN,采用左侧第一个Channel,而后点击菜单栏的Sequence-->Load Sequence-->From Sequence File…将咱们生存手段基因的txt文书档案导出到软硬件中。【翻开txt文书档案的功夫牢记在翻开窗口中的文献典型内里采用All Files】

引物设计教程:如何设计引物?  第5张

6、不妨看到序列被导出到了第一个Channel,双击这个Channel便不妨看到咱们的序列的精细消息。

引物设计教程:如何设计引物?  第6张

7、维持Channel 1选中的状况,采用Sequence-->Display Sequence,翻开对话框。

引物设计教程:如何设计引物?  第7张

8、采用对话框中的Reverse Complement Seq,其余的复选框都废除。而后点击OK。

引物设计教程:如何设计引物?  第8张

9、如许就不妨看到手段基因的反向互补序列了。

引物设计教程:如何设计引物?  第9张

10、对这个反向互补序列举行和上头安排正向序列引物一律的操纵,安排引物便可。简直的不复烦琐,我径直把我的安排截止报告大师:采用前24个碱基,也即TCAAAGATCTACCATGTACAGCTC,Tm值为57.6,比拟符合。到此引物安排就中断了。拿着方才安排的正向引物和这边安排的反向引物就不妨找公司帮咱们合成引物了。

引物设计教程:如何设计引物?  第10张

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